人类胚胎干细胞H1（干细胞库保藏）

复苏步骤：在开始复苏前，将所有试管、预热后的培养基和培养器具准备好，培养器具使用H1细胞铺底工作液完全覆盖瓶/皿底，置于37℃培养箱2h或过夜。（H1细胞铺底工作液：90%H1细胞铺底工作液-基础液+10%H1细胞铺底工作液-添加剂）已确保尽快完成复苏过程。①将冻存管从液氮中取出，快速在37℃水浴槽中解冻，轻柔持续地摇动冻存管，直到只剩下一个小冷冻团。从水浴槽取出冻存管，70%乙醇擦拭进行消毒。②使用移液管将冻存管中含有H1细胞的冻存液轻轻转移至一个含有5-6mL已经预热的完全培养基的15mL离心管中，过程必须轻柔防止吹散细胞团。③室温300g离心3min。④吸出培养基，确保细胞团完整。⑤然后缓慢加入1mL完全培养基，用手指轻弹离心管底部，使细胞团脱离底部并分散。⑥轻轻的将此1mI细胞悬液转移至已包被的培养皿/板/瓶，根据最终培养细胞的液体体积，加入ROCK inhibitor Y27632,终浓度为10μM。⑦将培养皿/板/瓶置于37℃培养箱中，每天更换培养基(换液不需要再添加Y27632,但培养基需提前预热)。
细胞传代或冻存：当集落变得较大、中心变得密集、明亮（对比边缘），相邻的集落开始融合时，此时可进行传代或冻存。①传代前，准备37℃预热好的无钙镁 PBS溶液及消化液，完全培养基。②吸走上清，并加入 37℃预热好的PBS溶液清洗1次。③加入适量（按 6 孔板每孔加 1mL，6cm 皿加 2mL，10cm 皿加3mL的量）的37℃预热好的消化液。④37℃放置1-2min，用手指轻弹皿/板/瓶身，显微镜下观察到大部分克隆边缘开始脱离培养皿/板底，克隆内部大部分细胞成团脱落。⑤加入适量的完全培养基终止消化。⑥移入离心管，300g离心3min。⑦离心后重悬（重悬步骤参照复苏4-5步）。⑧传代比例为1：6—1：8，根据最终培养细胞的液体体积，加入ROCK inhibitor Y27632，终浓度为10μM。⑨将培养皿/板/瓶置于37℃培养箱中，每天更换培养基（换液不需要再添加Y27632，但培养基需提前预热）。冻存同传代①-⑦，⑧使用预冷的冻存液轻轻的重悬细胞团，然后将细胞悬液转移至冻存管，冻存按 6 孔板每孔冻1支，6cm皿冻2支，10cm 皿冻3-4支。